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植物細胞色素C氧化酶,也稱為細胞色素氧化酶(COX)。它是細胞內(nèi)電子傳遞鏈末端的酶,具有質(zhì)子泵的作用,可以將H+由基質(zhì)提到膜間隙,同時可通過血紅素中鐵原子的氧化還原變化,將電子傳遞給分子態(tài)氧,最終形成水,并釋放出很多的能量。細胞色素C氧化酶是由兩個部分組成的,一部分是多肽鏈,其中包含13個蛋白質(zhì)。另外一部分是輔助因子,包括細胞色素C、細胞色素c氧化酶輔助蛋白、輔助因子I和輔助因子II。在細胞呼吸鏈中,細胞色素氧化酶起著重要的作用。
檢測細胞色素C氧化酶,這里推薦的是雙抗體夾心法。用純化的植物COX捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被的微孔中依次加入COX,再和HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。經(jīng)過洗滌后加入底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為藍色,最后加入酸轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺和樣品中的COX呈正相關(guān),在酶標(biāo)儀450nm波長下測定吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以計算出樣品中的COX含量。
為了快速的檢測,一般用elisa試劑盒的形式。試劑盒組成:說明書,封板摸,密封袋,酶標(biāo)包被板,標(biāo)準(zhǔn)品,酶標(biāo)試劑,樣品稀釋液,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液等。
操作步驟:標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加樣-加酶-溫浴37℃,60min-配液-洗滌-顯色-終止-測定。整個過程要按照說明書的順序進行,先看看注意事項,避免錯誤操作或忽略問題而導(dǎo)致偏差。
以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值,可以計算出樣品中含有COX的含量。這個含量還不是真實的含量,還要乘以稀釋倍數(shù),才能還原為最初的濃度。
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