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檸檬酸合成酶的測(cè)定方法
來源: | 作者:上海優(yōu)選生物 | 發(fā)布時(shí)間: 2025-03-18 | 10 次瀏覽 | 分享到:
檸檬酸合成酶,也稱為檸檬酸縮合酶。如果它要發(fā)揮作用,需要乙酰輔酶a和草酰乙酸作為底物。說來話長(zhǎng),這就要從三羧酸循環(huán)說起。檸檬酸合成酶催化乙酰輔酶a的乙基,和草酰乙酸的酮基結(jié)合,生成了檸檬酸輔酶a。這個(gè)時(shí)候,如果要得到檸檬酸,就要將檸檬酸輔酶a的輔酶a水解出來,生成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)。這個(gè)過程包括底物的氧化、脫羧、還原等反應(yīng),受到ATP,NADH,琥珀酰輔酶a抑制。乙酰輔酶a和草酰乙酸是影響到檸檬酸合成速率。

檸檬酸合成酶,也稱為檸檬酸縮合酶。如果它要發(fā)揮作用,需要乙酰輔酶a和草酰乙酸作為底物。說來話長(zhǎng),這就要從三羧酸循環(huán)說起。檸檬酸合成酶催化乙酰輔酶a的乙基,和草酰乙酸的酮基結(jié)合,生成了檸檬酸輔酶a。這個(gè)時(shí)候,如果要得到檸檬酸,就要將檸檬酸輔酶a的輔酶a水解出來,生成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)。這個(gè)過程包括底物的氧化、脫羧、還原等反應(yīng),受到ATP,NADH,琥珀酰輔酶a抑制。乙酰輔酶a和草酰乙酸是影響到檸檬酸合成速率。



檢測(cè)方法包括分光光度法,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。


1.分光光度法


檸檬酸合成酶(CS)催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A,進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸;該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,在 412nm處有特征吸光值。梯度稀釋,測(cè)定對(duì)應(yīng)的吸光度值,去除對(duì)照,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的檸檬酸合成酶的活性,也就是作用能力。樣品的測(cè)定,為了確保更準(zhǔn)確,可以多3個(gè)平行。



2.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法


采用的是雙抗體夾心法,測(cè)定樣品中的檸檬酸合成酶的含量。



用純化的植物檸檬酸合成酶(CS)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入植物檸檬酸合成酶(CS),再與HRP標(biāo)記的檸檬酸合成酶(CS)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物檸檬酸合成酶(CS)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物檸檬酸合成酶(CS)活性濃度。


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