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葉綠素a是植物中的一種很重要的色素,分子結(jié)構(gòu)是由4個吡咯環(huán)通過4個次甲基連接而成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。它參與植物的光合作用,將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能儲存在植物體內(nèi),為植物的新陳代謝提供足夠的動力。葉綠素a吸收的是藍(lán)紫光和紅橙光,它還參與植物體內(nèi)的多種生物化學(xué)反應(yīng),直接參與ATP和NADPH的生成。在浮游植物中,葉綠素a的含量和水質(zhì)的情況還是有關(guān)系的。一般情況下,通過測定葉綠素a的含量來評估水體的營養(yǎng)狀態(tài)。
它的分子式為C55H72MgN4O5,分子量為893.489,不溶于水,而溶于有機溶劑,如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。組成元素包括碳,氫,氧,氮,鎂等,酸性條件下,鎂離子易被氫取代形成去鎂葉綠素。在紅光區(qū)(640-660nm)和藍(lán)紫光區(qū)(430-450nm)具有強吸收峰。
檢測方法包括高效液相色譜(HPLC)法,分光光度法等。以HPLC為例,簡單的介紹一下檢測流程。
首先,要把葉綠素a從植物樣本中提取出來。比如,先剪碎,放在研缽中,加入碳酸鎂和適量的丙酮,研磨成漿糊狀。分次加入一定量的丙酮,獲取提取液。高速離心,得到上清液。轉(zhuǎn)入到容量瓶中,還用丙酮來定容。最后,用0.22um的膜過濾,準(zhǔn)備上機檢測。
常用的C18的色譜柱,250mm長,4.6mm內(nèi)徑,5um粒徑,柱溫30℃。流動相有甲醇-水、乙腈-水等。也可以參考,甲醇(含0.2%的乙酸)和丙酮,梯度洗脫,流速為1mL/min,進(jìn)樣量10μL,紫外檢測器,檢測波長430nm。色譜條件是不斷變化的,根據(jù)實際的樣品以及實驗環(huán)境。在實際檢測中,需要對方法進(jìn)行開發(fā)和驗證,獲得最優(yōu)的色譜條件,更準(zhǔn)確的有效的出峰。
采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式,根據(jù)測定出來的樣品的色譜峰面積,計算出葉綠素a的含量。
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